2023, Vol. 44
2. 天津市农业科学院 种质资源与生物技术研究所, 天津 300381
2. Institute of Germplasm Resources and Biotechnology, Tianjin Academy of Agricultural Sciences, Tianjin 300381, China
栝楼Trichosanthes kirilowii又名瓜蒌、吊瓜，是葫芦科栝楼属多年生藤本植物。栝楼的果皮、根、茎具有药用价值，栝楼籽又可作为休闲食品，经济价值较高。自20世纪80年代开发出栝楼食用、药用产品后，栝楼市场需求迅速增加，是我国大部分地区的支柱型特色产业[1-2]。栝楼已经成为安徽省大别山区主要经济作物，种植面积超过8000 hm2，主要集中在安庆市、潜山县、宿松县等地[3]。然而随着种植规模的扩大和种植年限的延长，近年来大别山区产地在每年7—10月份的栝楼果实成熟期，栝楼果实腐烂病发生加重，病果周身大面积变软、腐烂或严重脱水，干腐成僵果，在栝楼种植区该病害发生率约为15%~20%，在病害流行年份甚至达到50%，导致严重减产。因此，有效防治栝楼果实腐烂病是栝楼产业发展亟需解决的问题。
栝楼炭疽病不仅侵染叶片，也可为害果实。由炭疽病引起的栝楼果实症状初期为水浸状斑点，后逐渐扩大为近圆形凹陷的深褐色病斑。关于引起该病害的病原种类，韩翔[4]认为引起栝楼炭疽病的病原菌为长瓜刺盘孢Colletotrichum orbiculare。近年来研究报道胶孢刺盘孢C. gloeosporioides是导致栝楼炭疽病发生的主要致病因子[5-6]。Zhao等[7]在安徽省六安市田间发现，栝楼果实腐烂症状初期为水浸状病斑，后期病部出现白色霉状物直至腐烂，并将引起该病害的病原菌鉴定为Phytophthora capsici。孙凯等[2]在江苏省盐城市调查栝楼果实烂果病，将引起该病害的病原菌鉴定为拟茎点霉属Phomopsis。不同地理区域的栝楼产区，田间发生的果实腐烂病症状存在一定差异，且引起该病害的病原也具有多样性。因此，为进一步明确安徽省大别山栝楼产区果实腐烂病的病原种类，本研究开展栝楼腐烂病的病原菌分离、鉴定和致病性测定；利用形态学与分子生物学相结合的方法对病原菌进行鉴定；同时采用室内菌丝生长速率法测定7种常用杀菌剂对病原菌的抑制效果，以期为栝楼果实腐烂病防治提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试材料2019—2020年自安徽省安庆市大观区、潜山县和宿松县等地采集栝楼具腐烂症状的病果40份，将病样置于自封袋内，带回实验室用于病原菌的分离。从安徽有余跨越瓜蒌食品开发有限公司的基地采集大小均一、无病虫害、无机械损伤的栝楼果实，用于病原菌致病性测定，果实品种为‘皖蒌9号’。
马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉17 g，蒸馏水定容到1 L。水琼脂(Water-agar，WA)培养基：琼脂粉17 g，蒸馏水定容到1 L。康乃馨叶片琼脂(Carnation leaf agar，CLA)培养基：将剪碎后的康乃馨叶片灭菌烘干后置于水琼脂培养基上。
DL2000 DNA marker、2×Taq master mix购自北京康为世纪生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。RLD-500C-4 人工气候箱，宁波乐电仪器制造有限公司；C1000 Touch PCR仪，美国Bio-Rad公司；CKX53倒置显微镜，日本Olympus株式会社。
有效成分质量分数为99%的百菌清(Chlorothalonil)原药，利民化工股份有限公司；有效成分质量分数为98%的咪鲜胺(Prochloraz)原药，江苏辉丰生物农业股份有限公司；有效成分质量分数为95%的苯醚甲环唑(Difenoconazole)原药，深圳诺普信农化股份有限公司；有效成分质量分数为95%的氰烯菌酯(Phenamacril)原药，江苏省农药研究所股份有限公司；有效成分质量分数为70%的春雷霉素(Kasugamycin)原药、有效成分质量分数为95%的咯菌腈(Fludioxonil)原药、有效成分质量分数为95%的嘧菌酯(Azoxystrobin)原药，先正达作物保护有限公司。
1.2 病原菌的分离、纯化采用组织分离法[8]对病原菌进行分离和纯化。将采集的具有腐烂症状的栝楼病果，用灭菌剪刀在病健交界处剪取2~3 mm的病组织，先后经0.1%(φ)氯化汞溶液、75%(φ)乙醇溶液消毒，无菌水冲洗3次后转移至PDA平板上，置于28 ℃黑暗条件下培养。待长出菌落后挑取菌落边缘的菌丝进行纯化培养，并对分离所得的菌株进行编号，于PDA斜面保存。
1.3 病原菌的形态特征和致病性将纯化后的菌株接种于PDA培养基上，28 ℃黑暗条件下培养7 d，观察并记录菌落形态特征；在显微镜下观察菌株的分生孢子形态，并测量分生孢子大小。参照传统真菌分类方法[9-10]对病原菌进行形态学鉴定。
采用分生孢子悬浮液进行致病性测定。收集培养基上的分生孢子，无菌水漂洗后调节分生孢子悬浮液为107 mL−1。每个处理取3个健康、大小一致的‘皖蒌9号’栝楼果实，用φ为75%的乙醇溶液擦拭表面消毒后，用灭菌接种针将果实赤道部刺伤，伤口深约5 mm，然后将100 μL病菌分生孢子悬浮液滴于伤口处，用保鲜膜覆盖，并以接种等量无菌水为空白对照。果实接种后置于32 ℃、相对湿度90%、光照条件为12 h光∶12 h暗的人工气候箱中培养，观察并记录果实发病情况。待接种的栝楼果实发病后，从病组织处再分离病原菌，经形态学和分子生物学方法鉴定后，验证是否与原接种病原菌相同，完成柯赫氏法则。
1.4 生物信息学分析根据形态学特征分析结果，随机选择10个代表性菌株进行分子鉴定，其中，镰孢菌属3株(HP016、HP017、QSC2)，刺盘孢属7株(DMC2、HP002、HP009、DMC1、QSA6、SSA9、HKC10)。采用CTAB法[11]提取各菌株的基因组DNA，利用通用引物(TEF-1αF: 5′- ATGGGTAAGGAGGACAAGAC -3′, TEF-1αR: 5′- GGAGTACCAGATCATGTT -3′)[12]对镰孢菌属菌株的TEF-1α(Translation elongation factor)基因进行PCR扩增；采用6个目的位点的引物对刺盘孢属菌株的基因组DNA进行PCR扩增，包括ITS (ITS-1: 5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′, ITS-4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATA-3′)[13]、ACT基因(ACT-512F: 5′- ATGTGCAAGGCCGGTT-3′, ACT-783R: 5′-TACGAGTCCTTCTGGC-3′)[14]、CAL基因(CL1C: 5′-GAATTCAAGGAGGCCT-3′, CL2C: 5′-CTTCTGCATCATGAGC-3′)[15]、CHS-1基因(CHS-79F: 5′- TGGGGCAAGGATGCTT-3′, CHS-345R: 5′-TGGAAGAACCATCTGT-3′)[16]、TUB2基因(T1: 5′-AACATGCGTGAGATTG-3′, Bt2b: 5′-ACCCTCAGTGTAGTGA-3′)[17]和GAPDH基因(gpd1: 5′- CAACGGCTTCGGTCGC-3′, gpd2: 5′-GCCAAGCAGTTGGTTG-3′)[18]，以上引物均由通用生物(安徽)股份有限公司合成。
25 μL PCR扩增体系：10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，2×Taq PCR master mix 12.5 μL，基因组DNA 1.0 μL，ddH2O补足至25.0 μL。TEF-1α基因扩增程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃再次延伸10 min。ITS、ACT、CAL、CHS-1、TUB2、GAPDH基因扩增反应程序为94 ℃预变性90 s；94 ℃变性20 s，各自退火温度下退火20/30s，72 ℃延伸50 s，重复30个循环；72 ℃再次延伸5 min。每次反应均以不含模板DNA的反应体系作为阴性对照。PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后送至合肥擎科生物科技有限公司测序。
将测序获得的序列在GenBank 数据库中进行比对，并将序列递交GenBank，各菌株目的片段的序列登录号见表1。同时下载序列相似性高的菌株以及近缘种模式菌株的目的序列，用 ClustalX软件进行多序列比对，基于多位点的拼接序列，用MEGA 7.0软件以最大似然法(Maximum likelihood，ML)构建系统发育树。
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表 1 菌株信息及目的基因序列 Table 1 Strain information and target gene sequences |
采用菌丝生长速率法测定7种药剂对栝楼果实腐烂病病原菌的抑菌率。供试药剂母液用无菌水溶解稀释，设置5个质量浓度梯度。春雷霉素为500、100、50、10、5 μg/mL，咪鲜胺为1、0.5、0.1、0.05、0.01 μg/mL，咯菌腈为100、10、1、0.1、0.05 μg/mL，嘧菌酯为1000、100、10、1、0.1 μg/mL，苯醚甲环唑为10、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL；根据预试验结果，对于镰孢菌属的菌株，设置氰烯菌酯为100、10、1、0.5、0.1 μg/mL，百菌清为100、10、5、1、0.5 μg/mL。对于刺盘孢属的菌株，设置氰烯菌酯为100、75、50、25、10 μg/mL，99%(w)百菌清浓度梯度为1000、100、50、10、5 μg/mL。
在无菌操作条件下，不同质量浓度的杀菌剂溶液分别加入到灭菌的PDA培养基中，充分摇匀后等量倒入培养皿中，制成含有相应质量浓度药剂的平板，以加入等量无菌水的PDA培养基为对照。将供试菌株在PDA平板于28 ℃条件下培养5 d后，用打孔器在菌落边缘打取直径为5 mm的菌碟，接种到含药培养基中央和对照PDA平板中，每个浓度为1组处理，每组处理重复3次。待对照培养皿菌落长满平板时，采用十字交叉法测量各处理的菌落直径，计算菌丝生长抑制率(R)。
| $ R=(D_{对照}-D_{处理})/(D_{对照}-5 ) \times 100{\text{%}}, $ |
式中，D对照、D处理分别表示对照和药剂处理的菌落直径，mm。
根据毒力回归方程计算各药剂对病原菌菌丝的抑制中浓度(Median lethal concentration，EC50)。
2 结果与分析 2.1 栝楼果实腐烂病田间症状栝楼果实腐烂病初期症状为果实表面出现棕色或黑色的水浸状病斑，发病后期在田间表现为2种类型。一类为病果严重干腐，果实整体失水、质量减少，果皮凹陷且果实内部呈“空心”状，只剩一层果皮，成为挂在藤蔓上的僵果(图1A、1B)。另一类为病果周身发黄、变软并腐烂，果实表面有水渍状或黑色凹陷病斑，严重时病果开裂(图1C、1D)。
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图 1 栝楼果实腐烂病田间发病症状 Fig. 1 Sympthoms of fruit rot on Trichosanthes kirilowii in the field |
经鉴定，引起栝楼果实腐烂病的病原菌菌株有4种类型：Ⅰ类，菌株呈现白色菌落，气生菌丝发达、棉絮状(图2A)，小型分生孢子，卵圆形，无隔膜或最多2个隔膜，大小为7.1~9.1 μm×2.8~3.8 μm；大型分生孢子呈镰刀型，稍微弯曲，并且向两端逐渐变尖，3~5个隔膜，大小为20.2~28.5 μm× 4.2~5.3 μm(图2B)；Ⅱ类，菌株菌落为白色，中央菌丝体生长茂盛，气生菌丝扭结成束，类似网状结构(图2C)，小型分生孢子，卵圆形，无隔膜或最多2个隔膜，大小为7.2~9.3 μm×3.1~4.2 μm(图2D)；Ⅲ类，菌株呈灰白色，气生菌丝致密、棉絮状，中央散生橘色分生孢子堆，分生孢子圆柱形或梭形，两端钝圆，中央有1个油滴，大小为13.3~16.7 μm×3.3~6.7 μm (图2E、2F)；Ⅳ类，菌株呈灰黑色，气生菌丝短绒状、不发达；分生孢子圆柱形或梭形，两端钝圆，中央有1个油滴，大小为13.2~20.2 μm×5.1~7.2 μm (图2G、2H)。根据这4类菌株的形态学特征，结合张素轩[9]和刘晓云等[10]的描述，初步将Ⅰ、Ⅱ类菌株鉴定为镰孢菌属，Ⅲ、Ⅳ类菌株为刺盘孢属。
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图 2 病原菌的形态学特征 Fig. 2 Morphological characteristics of the pathogens |
从栝楼腐烂病果中共分离获得4种不同菌落形态特征的菌株，根据菌落和分生孢子等形态特征，将其初步归类为4个种群，采用刺伤接种法对选取的10个代表性菌株进行致病性测定。结果表明4种类型菌株均对栝楼果实有致病性。栝楼果实接种HP017和QSC2菌株4 d后，均出现黄褐色病斑，随着接种时间的延长，病斑逐步扩大，病斑颜色加深，呈黑褐色，病斑中心明显凹陷(图3A、3B)。栝楼果实接种HP002和SSA9菌株4 d后，也出现淡黄色水渍状病斑，接种14 d后，病斑直径分别达到6.5和4.8 cm，病斑呈灰白色(图3C、3D)。与田间观察到的栝楼果实腐烂病症状相似，而对照组果实则未发病(图3E)。将发病组织重新进行病原菌分离和鉴定，获得的菌株形态学特征和目的基因序列与原接种菌株一致。
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图 3 4种不同类型菌株对栝楼果实的致病性 Fig. 3 Pathogenicity of four different isolates on the fruit of Trichosanthes kirilowii A~D分别接种菌株HP017、QSC2、HP002、SSA9；E：对照 A−D: Inoculated with HP017, QSC2, HP002, SSA9, respectively; E: Control |
为进一步明确这4种类型的病原菌种类，分别对选取的10个代表性菌株进行分子鉴定。选取镰孢菌属菌株3株，对其TEF-1α基因进行PCR扩增，获得约700 bp的扩增片段，将目的片段测序后，在GenBank数据库中进行BLAST相似性序列比对，结果显示菌株HP016、HP017的TEF-1α基因序列(MW357640和MW357641)与藤仓镰孢菌Fusarium fujikuroi (MN861805和MK328876)的序列相似性达到100%；菌株QSC2的TEF-1α基因序列(MW357642)与层出镰孢菌F. proliferatum序列相似性达到98%。聚类分析进一步证实这些菌株分别与藤仓镰孢菌和层出镰孢菌紧密地聚成一簇(图4)。
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图 4 基于TEF-1α基因序列对镰孢菌属菌株构建的系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic tree of the strains of Fusarium spp. based on TEF-1α gene sequences 分支位置中的数字表示自举值；标尺表示每个核苷酸位点上的0.02替换值 The numbers in each branch points denote the percentages supported by bootstrap; The scale bar represents 0.02 substitutions per nucleotide position |
选取为刺盘孢属Colletotrichum的Ⅲ类菌株3株，对其6个位点(ITS、ACT、CAL、CHS-1、TUB2、GAPDH)进行多位点序列聚类分析。同样地对Ⅳ类4株代表性菌株的ITS、ACT、TUB2、GAPDH目的片段序列进行PCR扩增，测序后进行多位点序列聚类分析。菌株DMC1、QSA6、SSA9、HKC10与辽宁刺盘孢C. liaoningense参考菌株以100%的自举置信值聚在一起(图5)，表明该类菌株为辽宁刺盘孢；结果表明，菌株DMC2、HP002、HP009与果生刺盘孢C. fructicola参考菌株紧密地聚在一起(图6)，表明这些菌株为果生刺盘孢。结合形态学特征及分子鉴定结果，确定引起栝楼果实腐烂病的病原菌为藤仓镰孢菌、层出镰孢菌、果生刺盘孢和辽宁刺盘孢，且分离频率依次为31.4%、8.6%、20.0%和40.0%。
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图 5 基于4个位点序列对辽宁刺盘孢及其近缘种构建的系统发育树 Fig. 5 Phylogenetic tree of the strains of Colletotrichum liaoningense and related species based on the concatenated sequences of four loci “*”为模式菌株；节点上的数字为50%以上的自举值 “*” represent type strain; Bootstrap support values above 50% are shown at the nodes |
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图 6 基于6个位点序列对果生刺盘孢及其近缘种构建的系统发育树 Fig. 6 Phylogenetic tree of the strains of Colletotrichum fructicola and related species based on the concatenated sequences of six loci “*”为模式菌株；节点上的数字为50%以上的自举值 “*” represents type strain; Bootstrap support values above 50% are shown at the nodes |
通过菌丝生长速率法测定了7种药剂对4种病原菌(F. fujikuroi HP017、F. proliferatum QSC2、C. fructicola HP002和C. liaoningense SSA9)的毒力。从表2可以看出，针对2种镰孢菌(F. fujikuroi HP017、F. proliferatum QSC2)，咪鲜胺、咯菌腈、苯醚甲环唑、氰烯菌酯和百菌清的EC50为0.1046~5.1781 μg/mL，表明这5种杀菌剂抑菌效果强；春雷霉素和嘧菌酯的EC50较高，表明这2种药剂抑菌效果较差。对于果生刺盘孢和辽宁刺盘孢(C. fructicola HP002、C. liaoningense SSA9)，咪鲜胺、咯菌腈和苯醚甲环唑的EC50较小，范围为0.0097~2.1325 μg/mL；其次为春雷霉素和氰烯菌酯，百菌清的抑菌活性最弱。值得注意的是，嘧菌酯对C. liaoningense SSA9 的EC50为0.2274 μg/mL，而对果生刺盘孢C. fructicola HP002几乎没有抑制作用，这表明嘧菌酯对刺盘孢属内不同菌株的抑制效果差异明显。
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表 2 7种杀菌剂对镰孢病菌和炭疽病菌的室内毒力测定 Table 2 Determination of the virulence of seven fungicides to Fusarium spp. and Collrtotrichum spp. |
本研究通过组织分离法从栝楼果实腐烂病果中分离获得4种具有不同菌落形态的菌株，通过形态学特征分析和致病性测定，确定为镰孢菌属和刺盘孢属，其中刺盘孢菌分离频率较高。镰孢菌分布广泛，可侵染果树、蔬菜、水稻等作物并造成严重的经济损失[19-20]。刺盘孢菌具有分布广泛、种类繁多、寄主多样性的特性，可侵染西瓜和茶等作物，影响植物生长、发育和果实产量[21-22]。仅通过传统形态学特征分析难以确定引起栝楼果实腐烂病的病原菌种类，因此本研究结合多基因序列分析对病原菌进行种水平的鉴定。雷娅红等[23]报道镰孢菌TEF-1α基因可作为镰孢菌属的DNA条形码来区分镰孢菌。因此本文利用TEF-1α基因序列对镰孢菌属的菌株进行鉴定，最终将3株代表性镰孢菌确定为藤仓镰孢菌和层出镰孢菌。目前对刺盘孢属的分类鉴定主要利用ITS以及ACT、CAL、CHS-1、TUB2、GAPDH等基因的多位点序列分析[24]。本研究以多位点序列构建系统发育树，将获得的7株代表性刺盘孢属菌株确定为果生刺盘孢和辽宁刺盘孢。前人报道病原菌Phytophthora capsici可引起栝楼茎枯和果实腐烂[7]，Phomopsis被鉴定为引起栝楼烂果病的主要病原菌[2]，这均与本研究分离出的病原真菌不一致。由于不同研究者对调查的栝楼果实腐烂病的危害症状描述不同，推断这3种病害是由不同病原菌侵染造成的。
本研究进一步通过测定7种常用药剂对主要致病菌的抑制作用，结果发现咪鲜胺、咯菌腈、苯醚甲环唑对镰孢菌和刺盘孢菌的抑制效果最好。咪鲜胺、苯醚甲环唑等杀菌剂通过抑制病原菌麦角甾醇的合成，破坏真菌细胞膜的结构和功能，进而抑制病原菌生长[25-26]。咯菌腈属苯吡咯类杀菌剂，对镰孢菌和刺盘孢菌均表现出较强的抑制效果[27-28]。嘧菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，通过阻止病原菌ATP的合成和呼吸作用，抑制真菌孢子萌发或菌丝生长[29]。本研究结果发现嘧菌酯对镰孢菌有一定的抑制活性，但对刺盘孢属的不同菌株抑制效果差异明显，只对分离出的辽宁刺盘孢抑制效果较好，建议不应单一使用嘧菌酯，可交替或复配使用抑菌效果较好的咪鲜胺、苯醚甲环唑、咯菌腈等药剂。本研究只测定了杀菌剂对病原菌的室内毒力，后期还需开展大田药效试验以进行该病害防控，同时还应考虑生态环境、药剂成本、农药残留以及对栝楼生产安全的影响等多种因素。
| [1] |
徐劲峰, 檀根甲, 韩翔. 栝楼炭疽病发生危害及综合控制技术研究[J]. 安徽农业科学, 2006(15): 3741-3784. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2006.15.086 (  0) |
| [2] |
孙凯, 陈夕军, 沈迎春, 等. 江苏省栝楼烂果病病原鉴定及室内防治药剂筛选[J]. 江苏农业科学, 2020, 48(24): 112-116. DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2020.24.021 ( 0) |
| [3] |
吴朝晖. 安庆市栝楼产业现状及发展对策[J]. 安徽林业科技, 2020, 46(3): 56-58. DOI:10.3969/j.issn.2095-0152.2020.03.017 ( 0) |
| [4] |
韩翔. 瓜蒌炭疽菌的生理生态及病害防治的研究[D]. 合肥: 安徽农业大学, 2004.
( 0) |
| [5] |
LI H Y, ZHANG Z F. First report of Colletotrichum gloeosporioides causing anthracnose fruit rot of Trichosanthes kirilowii in China
[J]. Plant Disease, 2007, 91(5): 636-636. ( 0) |
| [6] |
ZHANG L X, SONG J H, TAN G J, et al. Characterization of Colletotrichum gloeosporioides responsible for anthracnose disease of Trichosanthes kirilowii Maxim in central China
[J]. Phytoparasitica, 2014, 42(4): 549-558. DOI:10.1007/s12600-014-0393-6 ( 0) |
| [7] |
ZHAO W, LI W, CHI Y, et al. Occurrence of stem blight and fruit rot caused by Phytophthora capsici on Chinese cucumber (Trichosanthes kirilowii) in China
[J]. Plant Disease, 2020, 105(1): 232. ( 0) |
| [8] |
方中达. 植病研究方法[M]. 北京: 中国农业出版社, 1998: 122-142.
( 0) |
| [9] |
张素轩. 镰刀菌属分类进展[J]. 真菌学报, 1991, 10(2): 85-94.
( 0) |
| [10] |
刘晓云, 景耀, 杨俊秀. 植物炭疽菌研究文献综述[J]. 西北林学院学报, 1995(4): 105-111. ( 0) |
| [11] |
刘小勇, 田素忠, 秦国夫, 等. 提取植物和微生物DNA的SDS-CTAB改进法[J]. 北京林业大学学报, 1997, 19(3): 100-103. DOI:10.3321/j.issn:1000-1522.1997.03.018 ( 0) |
| [12] |
SCHAAFAMA A W, LIMAY-RIOS V, TAMBURIC-ILLINCIC L. Mycotoxins and Fusarium species associated with maize ear rot in Ontario, Canada
[J]. Cereal Research Communications, 2008, 36: 525-527. ( 0) |
| [13] |
O'DONNELL K, CIGELNIK E. Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous
[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1997, 7(1): 103-116. DOI:10.1006/mpev.1996.0376 ( 0) |
| [14] |
WEIR B S, JOHNSTON P R, DAMM U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex
[J]. Studies in Mycology, 2012, 73(1): 115-180. ( 0) |
| [15] |
BERBEE M L, PIRSEYEDI M, HUBBARD S. Cochliobolus phylogenetics and the origin of known, highly virulent pathogens, inferred from ITS and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene sequences[J]. Mycologia, 1999, 91(6): 964-977. DOI:10.1080/00275514.1999.12061106 ( 0) |
| [16] |
CARBONE I, KOHN L M. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes[J]. Mycologia, 1999, 91(3): 553-556. DOI:10.1080/00275514.1999.12061051 ( 0) |
| [17] |
LIU F, CAI L, CROUS P W, et al. The Colletotrichum gigasporum species complex
[J]. Persoonia, 2014, 33(1): 83-97. DOI:10.3767/003158514X684447 ( 0) |
| [18] |
WHITE T J, BRUNS T D, LEE S B, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//INNIS M A, GELFAND D H, SAIMKY J J, et al. PCR Protocols: A guide to methods and applications. New York: Academic Press, 1990: 315-322.
( 0) |
| [19] |
陈宏州, 杨红福, 姚克兵, 等. 水稻恶苗病病原菌鉴定及室内药剂毒力测定[J]. 植物保护学报, 2018, 45(6): 1356-1366. DOI:10.13802/j.cnki.zwbhxb.2018.2018019 ( 0) |
| [20] |
王晓莉, 李哲, 叶文武, 等. 江苏省13个地区水稻种子携带4种不同恶苗病菌的LAMP检测[J]. 南京农业大学学报, 2020, 43(5): 846-852. DOI:10.7685/jnau.201912029 ( 0) |
| [21] |
王昌亮, 武海燕, 张猛. 河南省一例西瓜果实腐烂病病原鉴定[J]. 植物病理学报, 2011, 41(5): 542-545. DOI:10.13926/j.cnki.apps.2011.05.012 ( 0) |
| [22] |
HE L F, LI X X, GAO Y Y, et al. Characterization and fungicide sensitivity of Colletotrichum spp. from different hosts in Shandong, China
[J]. Plant Disease, 2019, 103(1): 34-43. DOI:10.1094/PDIS-04-18-0597-RE ( 0) |
| [23] |
雷娅红, 况卫刚, 郑春生, 等. 基于DNA条形码技术对镰刀菌属的检测鉴定[J]. 植物保护学报, 2016, 43(4): 544-551. DOI:10.13802/j.cnki.zwbhxb.2016.04.003 ( 0) |
| [24] |
刘威, 叶乃兴, 刘伟, 等. 茶树炭疽菌的鉴定及致病力分析[J]. 福建农林大学学报(自然科学版), 2015, 44(6): 581-586. DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.004 ( 0) |
| [25] |
杨媚, 冯淑杰, 何银银, 等. 柑橘炭疽病高效杀菌剂的筛选及抗药性菌株的发现[J]. 华南农业大学学报, 2013, 34(1): 28-31. DOI:10.7671/j.issn.1001-411X.2013.01.006 ( 0) |
| [26] |
赵金梅, 高贵田, 谷留杰, 等. 中华猕猴桃褐斑病病原鉴定及抑菌药剂筛选[J]. 中国农业科学, 2013, 46(23): 4916-4925. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.23.007 ( 0) |
| [27] |
徐建强, 平忠良, 马世闯, 等. 河南省小麦赤霉病菌对咯菌腈的敏感性[J]. 植物保护学报, 2018, 45(6): 1367-1373. ( 0) |
| [28] |
霍建飞, 姚玉荣, 郝永娟, 等. 天津市宁河区辣椒炭疽病病原鉴定及防治药剂筛选[J]. 北方园艺, 2020(3): 1-7. ( 0) |
| [29] |
PATEL J S, GUDMESTAD N C, MEINHARDT S, et al. Pyraclostrobin sensitivity of baseline and fungicide exposed isolates of Pyrenophora tritici-repentis
[J]. Crop Protection, 2012, 34: 37-41. DOI:10.1016/j.cropro.2011.10.015 ( 0) |