牛流行热(Bovine ephemeral fever)为虫媒介疾病，主要由库蚊属蚊子传播，可引起奶牛、水牛突发高热、肺炎、产奶产肉量下降、僵硬、跛、瘫、母牛流产等^[1-2]；最主要的特点是来势迅猛，突发高热，一般为双相热，可长达5 d左右，症状较轻者可自行恢复，重者致残、引起肺气肿导致死亡^[3]；呈现明显的季节性和周期性，在温暖潮湿的、适合蚊虫生长繁殖的热带和亚热带地区，约3~5年大流行1次，近年有周期缩短的趋势，在华南地区奶牛场几乎每年都会流行^[4]；发病率高达100%，青壮年牛易染病，死亡率1%~10%，最高可达到20%^[5]；对广东省畜牧经济影响重大，同时严重影响活体贸易^[6]。

牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus，BEFV)为弹状病毒科，暂时热病毒属成员，外形呈子弹状，病毒体的大小为85 nm×180 nm左右^[7]。目前为止，仅鉴定出1种血清型。病毒基因组约为14 900个核苷酸(nt)，按3'-N-P-M-G-[GNS-α1-α2-β-γ]-L-5'的顺序编码10个转录单位，目前已经确定了其中5种主要结构蛋白，包括核蛋白(Nucleoprotein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基质蛋白(Matrixprotein，M)、糖蛋白(Glycoprotein，G)和RNA依赖性聚合酶(Large multi-functional enzyme，L)，还有1个比较特殊的非结构糖蛋白II(Non-structural glycoprotein II，G_NS)，其基因为位于G基因下游的第2个糖蛋白基因，但在病毒粒子中并未发现该蛋白，可能在自然感染宿主的过程中发挥作用^[8]。

在我国，牛流行热于1934年首次在江苏省被报道。自1955年以来，该病迅速传播扩散到我国的25个省份，其中，包括平均海拔超过4 000 m的西藏地区^[9]。1991年8月位于我国44°N的吉林省某些地区报道出现了牛流行热。2011—2014年，对奶牛、水牛和耗牛进行血清学调查，在全国19个省、5个自治区和2个直辖市均检测到了BEFV中和抗体，其中，包括东北部的黑龙江^[10]。这些发现表明中国的BEFV感染范围可能比临床观察的要广。因此，本研究对近年流行的病毒进行连续监视，对了解流行病学模式、遗传进化以及病毒之间的抗原关系至关重要。

1 材料与方法 1.1 病毒株

JM 2020病毒原液分离于广东省江门市疑似牛流行热病牛全血，将牛全血样品接种入乳鼠脑内盲传3代，每代乳鼠脑组织都进行RT-qPCR检测^[11]。将第3代检测结果为阳性的脑组织匀浆处理后，用高速冷冻低温离心机在4 ℃条件下，6 000 r/min离心10 min，取上清液接种于BHK-21细胞，传代培养有明显病变后收集病毒液。采集的全血和冻存的病毒液均保存于华南农业大学兽医学院外科实验室。

1.2 主要试剂

通用RNA提取试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司，RNA反转录试剂盒购自TaKaRa有限公司，DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，pEASY^®-Blunt Simple Cloning Kit试剂盒购自全式金试剂公司，细胞用DMEM、PBS以及预染蛋白Marker购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 引物设计

从GenBank下载已发表的BEFV全长基因组序列^[12]，使用Primer Premier 5.0软件设计G基因以及10个片段引物(表1)。所有引物均合成于广州天一辉远基因科技有限公司。

1.4 RNA提取

根据通用RNA提取试剂盒说明书提取病毒液样品总RNA，取200 μL病毒液样品至无RNA酶的离心管中，避光加入1 mL RL溶液，涡旋震荡15 s后室温静置5 min；加入200 μL三氯甲烷，涡旋震荡15 s后室温静置3 min；高速低温离心机4 ℃、12 000 r/min离心10 min，样品将分为3层，取第1层水相层到新的无RNA酶的离心管中；加入水相层50%体积的无水乙醇，混匀后将溶液转移到纯化柱中，4 ℃、12 000 r/min，离心30 s，弃废液；加入500 μL RPI溶液，4 ℃、12 000 r/min离心30 s，弃废液；加入500 μL RW溶液，室温静置2 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 s，弃废液；加入500 μL RW溶液，室温静置2 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 s，弃废液；4 ℃、12 000 r/min离心2 min，充分晾干；将纯化柱转移到新的无RNA酶的离心管中，加入30 μL RNase-free ddH₂O室温静置2 min，4 ℃、12 000 r/min离心2 min，得到总RNA，储存于−80 ℃冰箱备用。

1.5 G基因及全基因组的扩增

PCR扩增G基因及有重叠序列的10个片段，反应条件为95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物于15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，结束后使用凝胶成像系统拍照观察；切下目的胶块用于纯化回收DNA片段；连接pEasy^®-Blunt载体后，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取单克隆菌落经PCR鉴定为阳性菌落后测序。

1.6 G基因进化分析及全基因组序列分析

对JM 2020毒株G基因全长序列、疫苗株JB76H、JT02L、LS11 2011等以及不同地区野毒株共70株毒株进行系统进化分析，使用DNAStar中Editseq和Megalign对G基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行编辑和相似性比较，并使用MEGA 6.0绘制BEFV G基因系统发育进化树，分析获得的野毒株G基因与其他地理株之间的差异。选取分支代表序列，先用邻近法构建初步进化树，然后用最大似然法重复计算构建进化树。

2 结果与分析 2.1 G基因与全基因组的扩增

以反转录的cDNA为模板，使用设计的引物分别对G基因(图1)及10个片段(图2)进行全基因组扩增，电泳结合测序结果显示在1 872、820、2 120、1 455、2 066、2 196、864、1 275、1904、2 181、2 185 bp处有明亮条带，与预期结果相符。将测序结果比对后进行拼接，JM 2020全长为14 902 nt。

2.2 G基因序列相似性及系统进化分析

为了更详细地研究广东BEFV毒株的遗传进化关系和分子流行病学，使用MEGA 6.0软件对测序所得的BEFV G基因与Genbank下载的国内外共70株毒株G基因进行分析并构建遗传进化树，结果显示，BEFV感染区域主要分为东亚、澳大利亚及中东3个地区；本毒株与中国、日本及泰国流行的毒株处于一大分支，与qy2017/China/2017、TH/NMA0012/2015/Thailand/2015、TH/NMA0025/2015/Thailand/2015、TH/NMA0076/2013/Thailand/2013、TH/NM0072/2017/Thailand/2017关系较近，JM 2020与疫苗株JB76H处于不同小分支，关系较远(图3)。

核苷酸序列相似性比对发现，JM 2020 G基因和全球BEFV G基因之间的核苷酸序列相似性为90.1%~99.3%；其中，与澳大利亚毒株的相似性最低，为90.1%~91.1%，与中东毒株相似性为92.0%~92.4%，与国内流行株相似性为95.5%~98.9%，与泰国地区毒株相似性为94.9%~99.3% (图4)。

G蛋白相对分子质量为72 300，含有特异的中和抗原位点，是诱导牛保护性免疫的主要抗原蛋白^[13]。G蛋白包括4个抗原位点：G1(第487~503 aa)，G2(第168~189 aa)，G3(第49~63 aa、第215~231 aa和第262~271 aa)和G4(第455~482 aa)；G基因序列有较高的保守性，在毒株之间具有超过90%的相似性；G蛋白抗原位点分析发现，在高保守性抗原蛋白的G2(T170N)、G3(K53N、G263E)及G4(K461E、I475M)出现5个氨基酸位点突变(图5)，这可作为近年来JB76H疫苗对广东地区保护效果差的原因之一。

2.3 全基因组系统进化树

应用MEGA 6.0软件构建JM 2020毒株全基因组系统进化树，结果显示，JM 2020毒株与泰国毒株TH/LRI0045/East Asia/2016亲缘关系最近，与南非毒株RSA/OBP/BEF2008/South Africa/2008亲缘关系最远(图6)。

2.4 全基因组结构分析

JM 2020病毒全基因组的GC含量为33.35%，包括1个50 nt的前导序列、1 296 nt的N基因、837 nt的P基因、672 nt的M基因、1 872 nt的G基因、1 812 nt的G_NS基因、618 nt的α1、α2基因、444 nt的β蛋白基因、345 nt的γ蛋白基因、6 444 nt的L基因和73 nt的尾随序列(表2)。每个基因的转录起始信号和转录终止信号序列保守，分别为AACAGG和CATGAAAAAAA，而α1、α2基因的转录终止信号序列为CTTGAAAAAAA。

分离株JM 2020前导序列与其他7株毒株前导序列的前31 nt高度保守，3′端前导序列和5′端尾随序列具有互补特性，最多可互补9 nt。此外，本毒株同qy2017及泰国株均出现P′基因截断^[14]的情况(图7)，P′蛋白是P基因多顺反子的产物，正常株P′为49 aa，JM 2020株P′为22 aa。截断的原因可能是基因发生突变，导致翻译提前终止。由此推测，P′蛋白是非功能性蛋白，不参与病毒结构的组成。截断的P′蛋白对病毒复制周期的影响仍有待阐明^[15]。

由表3可知，在氨基酸水平，N蛋白氨基酸序列最为保守，与其他毒株的平均相似性为98.9%；其次为L蛋白(平均相似性为97.9%)、G蛋白(平均相似性为96.6%)、M蛋白(平均相似性为95.2%)、G_NS蛋白(平均相似性为93.0%)和P蛋白(平均相似性为90.2%)。总体上，JM 2020毒株各基因与泰国株TH/LRI0045/East Asia/2016毒株相比变异最小，JM 2020全基因组和泰国分离株核苷酸序列相似性最高，为99.0%；这表明广东近年流行株JM 2020和泰国分离株很可能具有相同的起源。且有分析显示，BEFV分离株的进化关系与地理位置密切相关^[16-17]。

3 讨论与结论

牛流行热在广东省每年都有小范围流行^[17]，比中国其他地区更常见。根据本研究前期调研显示，2013—2017年，在两广地区每年都检测到BEFV，截至2022年，已检测到包括JM 2020在内共6株BEFV毒株。基于JM 2020全基因组序列的分子特征和G基因的系统发育分析，证明了JM 2020与其他地理区域，尤其是与泰国的BEFV遗传关系较近，这为BEFV在东亚和东南亚之间流通提供了证据。有证据表明，BEFV分离株之间的系统发育关系与地理位置密切相关^[16-17]。风和动物活体贸易在BEFV的跨界传播中起重要作用^[18]。由于季风环流的作用，夏季风在高温季节给泰国和我国的亚热带地区带来丰沛的降水，形成温暖湿润的气候，有利于泰国虫媒介乘风传入中国广东沿海地区，这为虫媒介的繁殖和传播病毒提供了有利的条件，由于BEFV核苷酸序列数量有限，东亚和东南亚之间的BEFV传播的具体途径仍然未知。中国为泰国农产品最重要的出口市场之一，但截至2022年，泰国牛肉还未获得中国市场准入许可，中泰两国还没有牛肉进出口方面的相关协议；因此，基本可以排除通过活体贸易传播BEFV的可能。

进化分析表明，JM 2020毒株与2017年在广东清远地区检测到的毒株qy2017核苷酸序列相似性为98.9%，与2017年以前广东地区检测到的BEFV序列相似性较低。但本毒株与2013—2017年的泰国流行株(TH/LRI0045/East Asia/2015等)G基因以及全基因组的核苷酸和氨基酸序列相似性均最高，G蛋白氨基酸序列相似性更是高达99.2%，这表明近几年所流行毒株应与泰国株密切相关，且2株毒株和泰国株处于同一分支，很可能具有相同起源。JM 2020与疫苗株JB76H、JT02L等国内毒株核苷酸序列相似性为95.1%~98.0%，存在一定进化距离。qy2017与泰国株的氨基酸序列相似性最高，为99.4%，表明该毒株很可能是从泰国传入，而JM 2020可能是1株新的突变株。这一研究对广东地区BEFV的流行及进化情况有了一定了解，丰富中国流行BEFV基因库的同时，为病毒的变异性研究和新型快速诊断技术的研发提供了新的BEFV种源，为开发有效、保护力更强的新疫苗^[19]提供了依据。

本研究成功扩增且测定了广东近年来流行毒株JM 2020全基因组，绘制了系统进化树，发现JM 2020与泰国株进化关系最近，核苷酸序列相似性最高，与澳大利亚毒株最远；与JB76H G基因核苷酸序列有一定差异。全基因组结构分析为在基因结构方面对BEFV进行分子研究提供了有用信息，了解BEFV的基因进化关系及基因组特征有助于广东省牛流行热流行病学的研究。